Le Dr Boye Schnack Nielsen partage des conseils pour réussir des tests d’hybridation in situ tout en fournissant des informations sur l’évolution des méthodes de détection d’ARN au fil du temps.
Le Dr Boye Schnack Nielsen est le directeur des affaires et de la recherche de l’unité d’histologie moléculaire de Bioneer AS
Les outils de diagnostic en histopathologie se sont traditionnellement concentrés sur l’étude des anomalies de l’ADN et des chromosomes et la mesure des niveaux de protéines. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les microréseaux, qui exploitent respectivement la stabilité des molécules d’ADN et de protéines, sont devenus des standards de référence pour étudier les profils moléculaires dans diverses maladies. Cependant, les scientifiques moléculaires savent depuis longtemps qu’ils perdent des informations cliniquement pertinentes lorsqu’ils sautent le riche contexte que l’analyse d’ARN fournit dans les variations des modèles d’expression génique.
Combler les lacunes
Contribuer à combler ce manque d’information est un objectif clé pour les histologues moléculaires tels que le Dr Boye Schnack Nielsen, qui est directeur commercial et de recherche pour l’histologie moléculaire chez Bioneer A / S. «Les ARN sont des groupes de molécules intéressants comprenant les ARN de transfert (ARNt) et les ARN ribosomaux (ARNr), qui sont plus connus, ainsi que les ARN longs non codants (lncRNA), les microARN (miARN) et les ARN circulaires (circRNA) , qui ont récemment pris de l’importance. Traditionnellement, les ARN n’ont pas été considérés comme des outils de diagnostic car les ARN sont facilement perdus en raison de la dégradation », explique Nielsen. «De plus, les méthodes de détection d’ARN ont souvent été compliquées, nécessitant la présence de techniciens de laboratoire qualifiés.»
Chez Bioneer, un fournisseur de services technologiques agréé par le ministère danois de la Science et de la Technologie, Nielsen et son équipe aident les entreprises à surmonter ces défis. Les projets en cours comprennent le développement et l’optimisation de méthodes de détection d’ARN telles que des tests d’hybridation in situ d’ARN et leur combinaison avec des techniques d’immunohistochimie. En tant qu’organisation de recherche sous contrat, Bioneer travaille aux côtés de ses clients biotechnologiques pour exécuter des projets de traduction sur le cycle de vie complet en biologie des maladies. Ces projets impliquent généralement de répondre à des questions en oncologie, sur le SNC et la recherche sur les cellules souches, ainsi que sur le développement et la production de médicaments candidats pour des études précliniques.
Le secret du succès: les tests de contrôle
«La clé du succès du travail sur l’ARN est de toujours exécuter des tests de contrôle», déclare Nielsen. «En cas d’échec d’une expérience, il peut être difficile de déterminer le coupable parmi les échantillons mal traités, les conditions expérimentales inadéquates et les sondes ARN avec une qualité de détection médiocre. Même les deux types de tissus utilisés pour le travail de l’ARN, les tissus congelés et inclus en paraffine, peuvent tous deux donner de bons résultats à condition qu’ils soient traités correctement », poursuit-il. «Lorsque votre test ne fonctionne pas comme prévu, vous devez tester différentes conditions expérimentales. Pour cela, vous comptez sur votre panel de tests de contrôle pour vous aider à résoudre le problème. J’utilise une combinaison de tissu de contrôle positif en interne pour tester la qualité de mon échantillon et de sondes de contrôle pour tester les performances de mes sondes. »
Au cours de la dernière décennie, le domaine du diagnostic de l’ARN a évolué rapidement, élargissant le champ d’application des techniques de détection de l’ARN, affirme Nielsen. «Des sociétés comme Advanced Cell Diagnostics (ACD) ont développé des méthodes innovantes de détection d’ARN à utiliser en histologie», explique Nielsen. «Pour assurer la facilité de mise en œuvre, ces dosages d’ARN sont adaptés pour une utilisation automatisée sur Leica et [Roche] Instruments Ventana couramment observés dans les laboratoires de pathologie. Se concentrant sur la sensibilité et la spécificité, ces tests sont également devenus plus reproductibles au fil des ans. »
L’une des méthodes les plus utilisées pour la coloration des miARN dans les échantillons cliniques est la technologie des sondes LNA depuis son introduction en 2010.1. Utilisant des analogues d’acide nucléique appelés acides nucléiques verrouillés, la technologie LNA utilise à la fois des méthodes chromogènes et fluorescentes pour détecter une gamme d’ARN ainsi que des molécules d’ADN. Alors que le LNA a une sensibilité et une spécificité de cible significativement plus élevées par rapport aux sondes d’ADN et d’ARN utilisées dans le passé, la reproductibilité peut encore être délicate pour certaines des molécules d’ARN les plus courtes.
Un test optimisé et fiable
Afin de remédier à cette lacune de la technologie LNA, les développeurs de tests d’ACD ont conçu le miRNAscope ™, un test d’hybridation in situ. Le miRNAscope permet de visualiser les oligonucléotides antisens (ASO), les miARN, les petits ARN interférents (siRNA) et d’autres cibles d’acides nucléiques courtes dans les tissus intacts ainsi que dans les cellules cultivées.
En tant que l’un des premiers pionniers de la technologie LNA, Nielsen savait que pour que le miRNAscope soit une véritable amélioration de la technologie LNA, il devait d’abord reproduire les résultats de cette dernière. Pour évaluer le miRNAscope, son équipe a utilisé des cibles qui sont généralement bien captées via le LNA, telles que U6, un petit ARN nucléaire, et le microARN-126, un microARN spécifique de l’endothélium. Et le miRNAscope a réussi le test avec brio, explique Nielsen: «Nous savons ce qu’il faut rechercher dans les schémas de coloration: avec le miRNAscope, nous voyons une localisation claire du microARN-126 dans les vaisseaux sanguins. De plus, pour un autre microARN qui n’a pas été détecté de manière reproductible avec la technologie LNA, nous voyons un meilleur rendement avec le miRNAscope. Ce n’est pas tout à fait inattendu compte tenu des efforts d’optimisation considérables qui ont permis de rendre le miRNAscope plus sensible », dit-il.
Perspectives d’avenir
Nielsen est ravi que le miRNAscope donne à des entreprises telles que Bioneer ainsi qu’à leurs clients une alternative pour détecter les microARN, autre que simplement via LNA. À l’avenir, il prévoit que miRNAscope constituera une amélioration significative des tests LNA, permettant une meilleure coloration d’une plus large gamme de microARN et améliorant la reproductibilité des tests. «Nous apprécions grandement le personnel innovant d’entreprises comme ACD, qui ne se concentrent pas seulement sur la conception de sondes et l’amélioration de la technologie de détection, mais sont également désireux de perfectionner de nouvelles étapes de traitement des tissus», déclare Nielsen. Alors qu’il attend avec impatience la prochaine utilisation de la version automatisée du kit miRNAscope, Nielsen conclut qu’il espère que le plein potentiel de la détection d’ARN dans le domaine de la biologie des maladies sera bientôt réalisé.
Les références
1. Jørgensen, S., Baker, A., Møller, S., & Nielsen, BS Robust one-day in situ protocole d’hybridation pour la détection de microARN dans des échantillons de paraffine à l’aide de sondes LNA. Méthodes, 2010.
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Le Dr Boye Schnack Nielsen partage des conseils pour réussir des tests d’hybridation in situ tout en fournissant des informations sur l’évolution des méthodes de détection d’ARN au fil du temps.
Le Dr Boye Schnack Nielsen est le directeur des affaires et de la recherche de l’unité d’histologie moléculaire de Bioneer AS
Les outils de diagnostic en histopathologie se sont traditionnellement concentrés sur l’étude des anomalies de l’ADN et des chromosomes et la mesure des niveaux de protéines. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les microréseaux, qui exploitent respectivement la stabilité des molécules d’ADN et de protéines, sont devenus des standards de référence pour étudier les profils moléculaires dans diverses maladies. Cependant, les scientifiques moléculaires savent depuis longtemps qu’ils perdent des informations cliniquement pertinentes lorsqu’ils sautent le riche contexte que l’analyse d’ARN fournit dans les variations des modèles d’expression génique.
Combler les lacunes
Contribuer à combler ce manque d’information est un objectif clé pour les histologues moléculaires tels que le Dr Boye Schnack Nielsen, qui est directeur commercial et de recherche pour l’histologie moléculaire chez Bioneer A / S. «Les ARN sont des groupes de molécules intéressants comprenant les ARN de transfert (ARNt) et les ARN ribosomaux (ARNr), qui sont plus connus, ainsi que les ARN longs non codants (lncRNA), les microARN (miARN) et les ARN circulaires (circRNA) , qui ont récemment pris de l’importance. Traditionnellement, les ARN n’ont pas été considérés comme des outils de diagnostic car les ARN sont facilement perdus en raison de la dégradation », explique Nielsen. «De plus, les méthodes de détection d’ARN ont souvent été compliquées, nécessitant la présence de techniciens de laboratoire qualifiés.»
Chez Bioneer, un fournisseur de services technologiques agréé par le ministère danois de la Science et de la Technologie, Nielsen et son équipe aident les entreprises à surmonter ces défis. Les projets en cours comprennent le développement et l’optimisation de méthodes de détection d’ARN telles que des tests d’hybridation in situ d’ARN et leur combinaison avec des techniques d’immunohistochimie. En tant qu’organisation de recherche sous contrat, Bioneer travaille aux côtés de ses clients biotechnologiques pour exécuter des projets de traduction sur le cycle de vie complet en biologie des maladies. Ces projets impliquent généralement de répondre à des questions en oncologie, sur le SNC et la recherche sur les cellules souches, ainsi que sur le développement et la production de médicaments candidats pour des études précliniques.
Le secret du succès: les tests de contrôle
«La clé du succès du travail sur l’ARN est de toujours exécuter des tests de contrôle», déclare Nielsen. «En cas d’échec d’une expérience, il peut être difficile de déterminer le coupable parmi les échantillons mal traités, les conditions expérimentales inadéquates et les sondes ARN avec une qualité de détection médiocre. Même les deux types de tissus utilisés pour le travail de l’ARN, les tissus congelés et inclus en paraffine, peuvent tous deux donner de bons résultats à condition qu’ils soient traités correctement », poursuit-il. «Lorsque votre test ne fonctionne pas comme prévu, vous devez tester différentes conditions expérimentales. Pour cela, vous comptez sur votre panel de tests de contrôle pour vous aider à résoudre le problème. J’utilise une combinaison de tissu de contrôle positif en interne pour tester la qualité de mon échantillon et de sondes de contrôle pour tester les performances de mes sondes. »
Au cours de la dernière décennie, le domaine du diagnostic de l’ARN a évolué rapidement, élargissant le champ d’application des techniques de détection de l’ARN, affirme Nielsen. «Des sociétés comme Advanced Cell Diagnostics (ACD) ont développé des méthodes innovantes de détection d’ARN à utiliser en histologie», explique Nielsen. «Pour assurer la facilité de mise en œuvre, ces dosages d’ARN sont adaptés pour une utilisation automatisée sur Leica et [Roche] Instruments Ventana couramment observés dans les laboratoires de pathologie. Se concentrant sur la sensibilité et la spécificité, ces tests sont également devenus plus reproductibles au fil des ans. »
L’une des méthodes les plus utilisées pour la coloration des miARN dans les échantillons cliniques est la technologie des sondes LNA depuis son introduction en 2010.1. Utilisant des analogues d’acide nucléique appelés acides nucléiques verrouillés, la technologie LNA utilise à la fois des méthodes chromogènes et fluorescentes pour détecter une gamme d’ARN ainsi que des molécules d’ADN. Alors que le LNA a une sensibilité et une spécificité de cible significativement plus élevées par rapport aux sondes d’ADN et d’ARN utilisées dans le passé, la reproductibilité peut encore être délicate pour certaines des molécules d’ARN les plus courtes.
Un test optimisé et fiable
Afin de remédier à cette lacune de la technologie LNA, les développeurs de tests d’ACD ont conçu le miRNAscope ™, un test d’hybridation in situ. Le miRNAscope permet de visualiser les oligonucléotides antisens (ASO), les miARN, les petits ARN interférents (siRNA) et d’autres cibles d’acides nucléiques courtes dans les tissus intacts ainsi que dans les cellules cultivées.
En tant que l’un des premiers pionniers de la technologie LNA, Nielsen savait que pour que le miRNAscope soit une véritable amélioration de la technologie LNA, il devait d’abord reproduire les résultats de cette dernière. Pour évaluer le miRNAscope, son équipe a utilisé des cibles qui sont généralement bien captées via le LNA, telles que U6, un petit ARN nucléaire, et le microARN-126, un microARN spécifique de l’endothélium. Et le miRNAscope a réussi le test avec brio, explique Nielsen: «Nous savons ce qu’il faut rechercher dans les schémas de coloration: avec le miRNAscope, nous voyons une localisation claire du microARN-126 dans les vaisseaux sanguins. De plus, pour un autre microARN qui n’a pas été détecté de manière reproductible avec la technologie LNA, nous voyons un meilleur rendement avec le miRNAscope. Ce n’est pas tout à fait inattendu compte tenu des efforts d’optimisation considérables qui ont permis de rendre le miRNAscope plus sensible », dit-il.
Perspectives d’avenir
Nielsen est ravi que le miRNAscope donne à des entreprises telles que Bioneer ainsi qu’à leurs clients une alternative pour détecter les microARN, autre que simplement via LNA. À l’avenir, il prévoit que miRNAscope constituera une amélioration significative des tests LNA, permettant une meilleure coloration d’une plus large gamme de microARN et améliorant la reproductibilité des tests. «Nous apprécions grandement le personnel innovant d’entreprises comme ACD, qui ne se concentrent pas seulement sur la conception de sondes et l’amélioration de la technologie de détection, mais sont également désireux de perfectionner de nouvelles étapes de traitement des tissus», déclare Nielsen. Alors qu’il attend avec impatience la prochaine utilisation de la version automatisée du kit miRNAscope, Nielsen conclut qu’il espère que le plein potentiel de la détection d’ARN dans le domaine de la biologie des maladies sera bientôt réalisé.
Les références
1. Jørgensen, S., Baker, A., Møller, S., & Nielsen, BS Robust one-day in situ protocole d’hybridation pour la détection de microARN dans des échantillons de paraffine à l’aide de sondes LNA. Méthodes, 2010.
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